ООО "ПОЛИРОНИК"

Аппараты и световоды для медицины, науки и техники

+7(495)333-80-57, +7(903)118-57-88

ЛАЗЕРНО-ВОЛОКОННЫЙ ФЛУОРИМЕТР ДЛЯ БИК-ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ НОВООБРАЗОВАНИЙ КОЖИ И СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК

И. П. Шилов, Л. Ю. Кочмарев, Е. П. Новичихин

I. P. Shilov, L. Yu. Kochmarev, E. P. Novichihin

Laser-fiber fluorimeter for NIR-luminescent diagnosis of skin and mucous membranes neoplasms

(Journal of Communications Technology and Electronics, 2022. Vol.67. No.4. PP. 463-469)

Институт радиотехники и электроники им В. А. Котельникова РАН, Фрязинский филиал

Аннотация. Разработан лазерно-волоконный флуориметр для люминесцентной диагностики опухолей кожи и слизистых оболочек, работающий в ближнем ИК-спектральном диапазоне (900-1100нм). Данный прибор, использующий фармацевтическую композицию на основе дикалиевой соли итербиевого комплекса 2,4-ди(α-метоксиэтил)дейтеропорфирина IX (Yb-ДМДП), обеспечивает достижение высоких значений люминесцентного диагностического контрастного индекса (ЛДКИ) новообразование/норма. Это позволяет с повышенной точностью определять границы распространенности новообразований кожи и слизистых оболочек.

Abstract.

Введение. По данным ВОЗ в мире наблюдается неуклонный рост онкологических больных. Только в РФ в 2018г. было зарегистрировано около 500.000 новых больных раком. Среди онкологических заболеваний на первые места начинают выходить кожные заболевания, что косвенно говорит о проблемах в области диагностики. Имеющиеся в настоящее время в распоряжении врачей спектральные устройства типа ЛЭСА-001 созданы в основном для спектрального диапазона 600-750нм, дающего в некоторых случаях ложно положительные результаты из-за присутствия в биотканях эндогенных порфиринов [1]. Эта аппаратура работает с фотосенсибилизаторами (ФС) типа «Фотодитазин», «Фотофрин», «Аласенс», которые создают при проведении флуоресцентной диагностики опухолей токсичные концентрации синглетного кислорода, который разрушает как больные ткани, так и здоровые [2]. Наиболее перспективным для биомедицинских диагностических исследований является ближний ИК-диапазон (БИК) из-за большей глубины проникновения фотонов через биоткань и минимальной аутофлуоресценции в этом диапазоне спектра [3]. Для БИК-спектрального диапазона (800-1100нм) с присущим ему так называемым “окном прозрачности“ в настоящее время отсутствует оптоэлектронная аппаратура повышенной чувствительности для детектирования сигнала люминесценции малой интенсивности.

Целью настоящей работы являлось создание макетного лазерно-волоконного флуориметра для БИК-люминесцентной диагностики (ЛД) рака кожи и слизистых оболочек (СО) на основе использования наноразмерных иттербиевых комплексов порфиринов (ИКП), которые в диагностических концентрациях не создают токсичных концентраций синглетного кислорода, и имеют при этом люминесцентные характеристики не хуже, чем используемые в настоящее время «терапевтические» ФС, при том же уровне туморотропности.

Материалы и методы.

При создании лазерно-волоконного флуориметра учитывались особенности разработанного ранее метода БИК-люминесцентной диагностики опухолей на основе использования ИКП [4,5].

В основе метода лежат два явления: 1) избирательность накопления люминесцирующего маркера-фотосенсибилизатора в тканях новообразований и возможность его обнаружения по характерной люминесценции на освещаемой лазерным излучением области; и 2) различия в интенсивности люминесценции здоровых и патологически измененных тканей при их возбуждении лазерным излучением в ультафиолетовом диапазоне спектра.

Свойство ФС селективно накапливаться в опухолевых тканях называется тропностью к раковым клеткам (или туморотропностью). Использование метода ЛД, являющейся по сути оптической биопсией, предпочтительней традиционной диагностики, требующей удаления нескольких квадратных миллиметров тканевой поверхности и последующего ожидания результатов гистологического исследования.

Следует отметить, что разработанные ИКП, являются перспективными субстанциями для ЛД опухолей в БИК-области спектра. Эти соединение характеризуются люминесцентным сигналом повышенной интенсивности в спектральном диапазоне 900-1100нм, что позволяет детектировать их при концентрации порядка 10^-4M и ниже. Они обладают повышенными фотофизическими свойствами, в частности высоким коэффициентом экстинции (1,5х10⁵ М^-1см^-1 ) и временем жизни люминесценции до 20 μs.

Необходимо также подчеркнуть, что Yb -ион во всем диапазоне энергий, вплоть до энергий, соответствующих УФ области спектра, имеет только два энергетических уровня: основной (⁴F_7/2) и возбужденный (²F_5/2). Важным свойством иона иттербия является сильная связь его электронной подсистемы с фононами решетки [6], вследствие этого линии электронных переходов сильно уширяются. Электронные уровни ²F_5/2 и ⁴F₇/₂ расщепляются на 3 и 4 вырожденных уровня соответственно. По этой причине 4f-люминесценция Yb -иона в иттербиевых комплексах наблюдается в достаточно широком спектральном БИК-диапазоне 920-1060нм, при возбуждении в диапазоне 300-630нм. ИК-люминесценция Yb -ионов вызвана переходами 4f-электронов: 2F5/2 → 2F7/2. Типичные спектры люминесценции для различных ИКП представлены на Рис.1. Как видно из Рис.1. в БИК-диапазоне спектра наблюдаются две основные люминесцентные полосы вблизи 930нм и 980нм (наиболее сильная) и многочисленные эмиссионные полосы в спектральном диапазоне 900-1100нм. В связи с этим появляется возможность в конструкции ЛВФ отказаться от использования монохроматора, а использовать для сбора интегрального малого сигнала люминесценции весь спектральный диапазон 900-1100нм с помощью системы интерференционных фильтров.

Рис.1. Спектры люминесценции образцов ИКП:

1.Yb-комплекс 5,10,15,20-тетра(1-N-(п-фторфенил)-3(о-хлорфенил) пиразол-4-ил)порфирина (40% раствор ДМСО, концентрация комплекса-10^-5 М)

2. Yb-комплекс 2,4-ди(α-метоксиэтил)дейтеропорфирина IX (Yb-ДМДП) (40% раствор ДМСО, концентрация комплекса-10^-5 М) .

Разрабатываемый ЛВФ в связи с отсутствием в его структурной схеме стационарно устанавливаемого монохроматора, настроенного только на одну эмиссионную полосу с максимальной интенсивностью люминесценции (~980нм) [5], обеспечивает повышенный сбор полезного сигнала, что ведет к существенному увеличению чувствительности.

Результаты.

Лазерно-волоконный флуориметр. Устройство и принцип работы.

На Рис.2 представлена блок-схема макетного ЛВФ (разработки ФИРЭ им. В. А. Котельникова РАН) для БИК-люминесцентной диагностики опухолей кожи и СО.

Рис.2. Блок-схема ЛВФ

1-405нм-полупроводниковый лазер, 2-блок модуляции и оцифровки (БМО), 3-ноутбук, 4-блок регистрации и обработки сигнала люминесценции (БРОСЛ), 5-волоконно-оптический зонд (ВОЗ), 6-биоткань.

Устройство базируется (Рис.2) на основе компактного полупроводникового лазера (1) разработки НТЦ волоконно-оптических устройств (ВОУ), г. Москва; блока модуляции и оцифровки 2 (БМО), включающего аналогово-цифровой преобразователь (АЦП-ЦАП); ноутбука 3; блока регистрации и обработки сигнала люминесценции 4 (БРОСЛ), включающего систему интерференционных фильтров, фотодиодного модуля (ФДМ) с предусилителем, системы линз; многожильного высокоапертурного волоконно-оптического зонда 5 (ВОЗ) на основе кварцевых волоконных световодов (КВС) состава SiO₂ -F/SiO₂ (SiO₂ -сердцевина световода, SiO₂ -F-светоотражающая оболочка).

Заготовки состава SiО₂-F/SiО₂ с повышенной числовой апертурой изготавливались на макетной СВЧ-плазмохимической установке (разработки ФИРЭ им. В. А. Котельникова РАН), которая подробно описана в [7]. Вытяжка КВС из получаемых заготовок осуществлялась по известной технологии с использованием графитовой печи [8].

На основе анализа спектральных потерь в диапазоне 0,18-1,10 мкм для создания центрального световода ВОЗ (обеспечивающего возбуждение люминесценции излучением на длине волны 405нм) было выбрано оптическое волокно типа UV200/220/290-AL с металлическим (алюминий) защитным покрытием и числовой апертурой NA=0,30. Волокна, покрытые алюминием, обеспечивают полную защиту от проникновения посторонних оптических сигналов через боковую поверхность, что существенно при анализе спектров люминесценции. КВС с относительно высоким содержанием гидроксил-ионов (1200-1300 ppm, КВС типа UV) обеспечивают минимум оптических потерь и искажений спектров в диапазоне 180-650нм. В качестве периферийных световодов для детектирования малого сигнала люминесценции в БИК-диапазоне спектра 900-1100нм использовались оптические волокна типа WF200/220/245P с полиимидным защитным покрытием. На Рис. 3 представлена конструкция 19-жильного высокоапертурного зонда повышенной чувствительности обнаружения ФС. Использование высокоапертурных ВОЗ (с числовой апертурой N. A.~0,30 и более) на основе кварцевого стекла повышает производительность процесса ЛД, а также чувствительность всего устройства диагностики. Чувствительность ЛВФ по обнаружению ФС составило менее 20мкгр/кг веса биообьекта. Следует отметить, что в целом ряде спектрально-диагностических установок типа ЛЭСА (ООО “Биоспек”) [9] , которые используют в конструкции ВОЗ кварцевые волоконные световоды (КВС) подобного состава, но со стандартной числовой апертурой 0,20-0,22, чувствительность обнаружения ФС не превышала ~50мкг/кг веса биообьекта (минимально определяемая концентрация ФС) [10] .

Рис.3. Конструкция 19-ти жильного волоконно-оптического зонда лазерно-волоконного флуориметра.

В качестве ИФ были использованы фильтры типа SL 930-1100. Их спектральные характеристики, выполненные на спектрофотометре “Shimadzu” UV-3600, представлены на рис. 4. Как видно из рис. 4, пропускание в оптическом диапазоне 900—1100нм составляет вплоть до 80%. При этом степень блокировки возбуждающего излучения составляет не менее 10^-4 %.

Рис.4. Спектральные характеристики интерференционных фильтров типа SL 930-1100.

Программа, установленная на ноутбуке, разработана в ИРЭ им. В. А. Котельникова РАН и зарегистрирована в Реестре программ для ЭВМ (Свидтельство № 2018617536). Она формирует сигнал, моделирующий световой поток и представляющий собой прямоугольный импульс с заданным периодом (меандр). Алгоритм обработки поступающих данных основан на идеологии синхронной фильтрации (синхронного усреднения). В нашем случае интерес представляет общая величина ответного сигнала, а не его форма, поэтому отпадает необходимость строго синхронизовать моменты снятия ответного сигнала с импульсами моделирующего сигнала. При обработке происходит отдельное усреднение сигнала на максимуме меандра и усреднение сигнала на минимуме меандра. Это позволяет практически избавиться от шума и получить информационный результат в виде разности (или отношения) эти двух величин, который показывает уровень накопления введенного вещества в исследуемой ткани. Процедура получения и обработки сигналов должна происходить в режиме реального времени, поэтому оптимизация параметров, управляющих прибором (процессом), определяется возможностями аппаратуры (АЦП, ЦАП, компьютер и др.) и может происходить в процессе эксплуатации системы. Приемлемые области основных упраляющих параметров представлены в таблице 1.

Таблица 1. Параметры управления прибором.

№	Параметр:
11	Частота модулирующего сигнала	10-30 Гц
22	Амплитуда модулирующего сигнала (при внешней модуляции)	1-4 вольта
33	Период получения сигнала	0.5-1.0 сек
44	Количество отсчетов за период	500-1000
55	Сдвиг (технический параметр, оптимизирующий величину результата, доля периода модулирующего сигнала)	0.2-0.3

Принцип работы ЛВФ следующий. Излучение от лазера (1) с регулируемой оптической мощностью (до 10 мВт) через центральный световод волоконно-оптического зонда (5) попадает на пораженную биоткань (6), в которой селективно накоплен ИКП. С помощью БМО (2) обеспечивается модуляция лазерного излучения. Частотой и амплитудой модуляции управляет программа, установленная на ноутбуке (3). Далее малый сигнал ИК-люминесценции иона иттербия после УФ-возбуждения вместе с фоновыми флуоресцентными сигналами от эндогенных порфиринов и других хромофоров биоткани (флавины. коллагены и т. д.) через приемные периферийные световоды ВОЗ поступает в БРОСЛ (4). Данный блок (состоящий из системы короткофокусных линз, интерференционных фильтров, ФДМ с предусилителем) устраняет попадание на ФДМ возбуждающего излучения (405нм), а также фоновой аутолюминесценции , образующейся в основном в зеленом и красном диапазоне спектра. Полезный же сигнал ИК-люминесценции после усиления и оцифровки с помощью АЦП-ЦАП, который расположен в БМО (2), поступает на ноутбук (3) с разработанной программой.

На ноутбуке детектируемый сигнал представлен в виде усредненной за время получения сигнала интегральной интенсивности люминесценции от данной зоны локализации ВОЗ. Следует отметить, что ЛВФ с его волоконно-оптическим зондом по сути является биомедицинским фотонным локатором.

Основные технические характеристики устройства представлены в Таблице 2.

Таблица 2. Технические характеристики ЛВФ.

№	Параметры фильтров:
1	Коэффициент пропускания (в полосе спектра 850-1000нм), %	До 70
2	Коэффициент пропускания (в полосе фонового спектра 350-850нм), %	<0,001
3	Спектральный диапазон измерений, нм	900-1100
4	Фотодиодный модуль с предусилением	S9269, (Hamamatsu)
5	Пороговая чувствительность, фемтоВт	<0,1
	Волоконно-оптический зонд:
	Тип зонда	Многожильный: 8, 13 или 19 жил
	Тип световодов зонда	кварц-кварц, SiO₂-F/SiO₂
	Числовая апертура световодов	до 0,30
	Оптическая мощность лазера, мВт	до 30
	Рабочая длина волны лазера, нм	405
	Чувствительность обнаружения препарата, мкгр/кг	До 20,0

В качестве диагностикума для проведения процедуры ЛД поражений кожи и слизистой использовалась фармацевтическая композиция (ФК) на основе дикалиевой соли итербиевого комплекса 2,4-ди(α-метоксиэтил)дейтеропорфирина IX (Yb-ДМДП). ФК в виде геля прошла соответствующую Госсертификацию (№ РОСС RU.0001.510608), и получила название гель «Флюроскан».

С помощью разработанного устройства нами осуществлялся процесс изучения люминесцентного диагностического контрастного индекса (ЛДКИ) от различных участков кожи и СО. Значение ЛДКИ (y_s) оценивалось по формуле: y_s =I/I₀

где: I и I₀- интегральные интенсивности БИК-люминесценции опухоли и других биотканей (например, соседней нормальной биоткани) соответственно.

Исследования ЛДКИ новообразование/норма при воспалительных и пролиферативных процессах с применением разработанного макета ЛВФ проводятся в настоящее время в ГНЦ «Лазерной Медицины», Москва на пациентах-добровольцах с различными поражениями кожи, а в 1-ом МГМУ им. И. М. Сеченова, МЗ РФ, Москва, выполнялись исследования по ранней диагностики рака шейки матки (РШМ) [11]. Проведенные исследования показали, что интенсивность люминесценции от тканей шейки матки без патологических изменений варьировалась от 0,016 до 0,026 мВ, в то время как интенсивность люминесценции от тканей РШМ с плоскоклеточными интраэпителиальными поражениями высокой степени (HSIL) увеличивалась до 0,75 мВ, т. е. более чем на порядок величины.

Заключение.

1. Разработанная конструкция макетного ЛВФ БИК-спектрального диапазона в сочетании с применением созданной ФК обеспечивает достижение высоких значений ЛДКИ новообразование/норма (5-50), что позволяет с повышенной точностью определять границы распространенности кожных новообразований. При этом возможно также изучение накопления ИКДГ при воспалительных и пролиферативных процессах с целью выявления их отличий от раковых заболеваний, контроля за наличием или отсутствием пролиферации клеток и изменением накопления ИКДГ в процессе лечения.

2. Представленный ЛВФ обеспечивает повышенный сбор полезного сигнала люминесценции Yb-иона, что ведет к существенному увеличению чувствительности обнаружения ФС. При этом достигается еще одна цель разработки: резкое снижение дозы вводимого в организм препарата. Уменьшаются также габариты и вес устройства, которое может быть использовано в передвижных медицинских лабораториях для диагностики различных групп населения, включая удаленные обьекты.

Работа выполнена в рамках Государственного задания. Авторы выражают благодарность проф. Ковалеву М. И. (1-ый МГМУ им. И. М. Сеченова, МЗ РФ, Москва) за проведение совместных работ по применению метода БИК-люминесцентной диагностики в гинекологии.

Список литературы

1. Zaak D., Alexander K., Stepp H. et al. // Diagnosis of urothelial carcinoma of the bladder using fluorescence endoscopy // B J. U International. Doi:10/1111/j.1464-410x.2005. 2005. P. 217-221.

2. Ю.В. Алексеев, В.Д. Румянцева, И.П. Шилов, А.В. Иванов, Н.М. Шумилова, О.В. Миславский / Перспективы применения иттербиевых комплексов порфиринов в клинической практике// Лазерная медицина, 2017, №2.

3. Venkatesan Perumal, Sivakumar P. M., Ali Zarrabi et al. / Near infra-red polymeric nanoparticle based optical imaging in cancer diagnosis/ J. of Photochemistry& Photobiology, B: Biology. 2019. 199. 111630.

4. A. V. Ivanov, V. D. Rumyantseva, K. S. Shchamkhalov, and I. P. Shilov. //Luminescence Diagnostics of Malignant Tumors in the IR Spectral Range Using Yb-Porphyrin Metallocomplexes// Laser Phys. 2010. V. 20(12). P. 2056-2065.

5. Gaiduk M.I., Grigoryants V.V., Mironov A.F. et al. // Fibre-laser IR-luminescence diagnostics of malignant tumours using rare rarth porphyrins// J. Photochem. Photobiol., B: Biology. 1990. V. 7. № 1. P. 15–20.

6. К. Н. Болдырев, М. Н. Попова, Л. Н. Безматерных, М. Беттинелли. // Неэквивалентные центры Yb в одноцентровых лазерных кристаллах Y-Yb-Al (BO ) //Ж. Квантовая электроника, 41, №2, 2011. С. 120-124.

7. Бабенко В. А., Кочмарев Л. Ю., Шилов И. П. Сверхвысокочасотный разряд волноводного плазмотрона для осаждения высокоапертурных структур на основе кварцевого стекла. Радиотехника и Электроника. Т. 50. №1. 2005. С. 100-107.

8. Замятин А. А., Маковецкий А. А., Шилов И.П. Кварц-кварцевые и кварц-полимерные силовые волоконные световоды с термопластичным защитным покрытием, наносимым непосредственно в процессе их вытяжки. Радиотехника и Электроника. 2004. Т. 49. №. 9. С. 1150-1152.

9. Лощенов В. Б., Стратонников А. А., Волкова А. И., Прохоров А. М. Портативная спектроскопическая система для флуоресцентной диагностики опухолей и контроля за фотодинамической терапией. Журнал Российского химического общества им. Д. И. Менделеева. Т. XLII. N5. 1998. С. 50-53.

10. Установка ЛЭСА-01-БИОСПЕК. www. Biospec.ru.

11. Ковалева А. М., Иванов А.В., Шилов И.П., Алексеев Ю.В., Вознесенский В.И., Поминальная В.М., Ковалев М.И. // Диагностика рака шейки матки по оценке интенсивности люминесценции при помощи спектрофлуорометрии // Российский биотерапевтический журнал. Т.17. 2018. С.36-37.

Авторы:

1. Шилов Игорь Петрович-зав. лабораторией ФИРЭ им. В. А. Котельникова РАН, к.т.н., 916-6230362, laserlab@ms.ire.rssi.ru

2. Кочмарев Леонид Юрьевич-с.н.с. , ФИРЭ им. В. А. Котельникова РАН, 905-7023001, kochmarev48@mail.ru.

3. Новичихин Евгений Павлович, вед. инженер, к.т.н., ФИРЭ им. В. А. Котельникова РАН, 903-7332125, laserlab@ms.ire.rssi.ru